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    公司動態

    單細胞凝膠電泳標準操作

    實驗原理:
    在細胞核中,DNA是環狀附著在核基質上,細胞裂解過程中,核基質被溶解、抽提,DNA的結構則未發生變化。如果DNA鏈上存在缺口,則使DNA超螺旋變的松弛,DNA環向外展,同時由于暴露了陰電荷,在電場力的作用下,松動的DNA環向陽極遷移,但是由于這種松動的DNA環一端仍附著于核DNA,其遷移距離受到限制,因此尾長并不總是真實反映鏈缺口的多少。實際應當依靠尾長與尾部的熒光強度同時來進行分析。

    實驗步驟:
    1. 分離制備單細胞懸液:
       1) 體外培養的細胞株:用胰酶消化,吹打成單細胞懸液;
       2) 體內臟器細胞:處死動物,取出臟器,于Hanks’液中制備成單個細胞懸液。
    2. 膠板制備:
       1) 取20~50μl于56℃水浴中保溫的0.5%普通熔點瓊脂糖,鋪于磨沙載玻片上,形成底膠。
       2) 取100~150μl 0.5%普通熔點瓊脂糖加在底膠上,再于其上加蓋玻片,4℃冷凝10分鐘。
       3) 取下蓋片,取50~100μl于37℃水浴中保溫的1.0%的低熔點瓊脂糖與50~100μl細胞懸液(105個細胞/ml)混勻,立即鋪片,加上蓋玻片,4℃冷凝10分鐘。
       4) 去掉蓋玻片,取70~100μl于37℃水浴中保溫的0.5%的低熔點瓊脂糖鋪片,加蓋玻片,4℃冷凝。
    3. 細胞裂解與電泳:
       1) 將制備好的膠板去掉蓋玻片后,浸于4℃預冷的細胞裂解液中,4℃裂解1小時。
       2) 取出膠板,放入電泳槽中,浸泡在電泳液中解旋20分鐘。
       3) 4℃電泳20分鐘(25V,300mA)。
    4. 中和與染色:
       1) 電泳結束,將膠板浸泡于中和液中,每次15分鐘,共中和兩次,注意更換中和液。
       2) 取出膠板,置于染色架上,滴加5μg/ml的PI,暗處染色20分鐘。
       3) 蒸餾水脫色15分鐘。
    5. 鏡檢和分析:
       1) 在熒光顯微鏡下觀察,綠光激發吸收濾片590nm。必要時照相記錄。
       2) 記數觀察的細胞,記錄彗星細胞出現的頻率,用目鏡測微尺測頭長與全長,計算核DNA遷移距離。

          使用兩層凝膠法,經裂解、DNA解旋、電泳和中和得到濕瓊脂糖凝膠片。將濕瓊脂糖凝膠片置于冰冷無水乙醇中脫水10分鐘,后置于空氣中自發干燥。全部操作在采血后8小時內完成,操作過程中注意避光。使用50μl 30μM的溴乙錠溶液染色、照相。使用單細胞凝膠電泳軟件分析所有照片,隨機測量100個以上細胞的尾長和olive尾矩,以尾長和olive尾矩的算術均數代表個體DNA損傷情況。

    滬公網安備 31011402005168號

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