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    公司動態

    成年豬胰島分離純化方法的優化



    實驗試劑

    膠原酶V,512 kut/mg(Sigma公司),DNA酶(Sigma公司),胎牛血清(Gibco公司),RPMI1640培養液(Gibco公司),Dextran(Pharmacia公司),Hanks平衡鹽溶液(Gibco公司)。以上實驗產品上海創賽科技均可現貨供應,歡迎撥打創賽免費專線4006087598訂購咨詢。


    實驗設備

    離心機,注射器,顯微鏡,超凈工作臺等。


    實驗材料

    成年雜種豬,豬齡12 mo,體質量150 kg左右,豬被屠宰放血后,在相對無菌條件下迅速取出胰腺,保存于4℃ Hanks液中送至實驗室,熱缺血時間少于10 min,冷缺血時間少于90 min。


    實驗步驟

    1. 胰島分離
    胰腺取回后,置于超凈工作臺上,快速去除胰周組織、脂肪、血管及外科被膜,保留固有被膜。從胰頭、胰體交界部橫斷胰腺,找到主胰管,用20 G套管針插入,縫合線結扎,尾部遠端亦結扎切斷,每次均取約15-20 g組織,注入4℃含Ca2 Hanks液配制的復合膠原酶溶液(1.5 g/L,內含DNA酶0.3 g/L),注入量 = 胰質量×2,注射速度7 mL/min,3-4 min內完成,置入玻璃容器內,在38.5±0.1℃水浴中震蕩消化,震速100 r/min,在消化過程中間斷加入0.1 mmol/L的NaOH,使消化液pH值盡可能維持在7.8左右,從消化20 min開始每間隔4 min取樣一次,雙硫腙染色鏡檢,當胰腺組織被消化裂解成細沙狀,鏡檢見大部分結構完整的胰島從外分泌組織中脫落出來,立即用4℃冷Hanks液(含100 mL/L胎牛血清)終止消化,充分混勻后,用40目鋼網過濾,收集消化后組織,4℃離心冼滌2次,去除脂肪等雜質細胞,取樣鏡檢計數和觀察消化后胰島分離情況。
    2. 胰島純化
    用Dextran配制成密度為1.037,1.054,1.070,1.096,1.11 kg/L的不連續密度梯度液,依次將不連續密度梯度液各10 mL加入50 mL離心管中,*后將洗滌后的消化組織每0.5 mL與1.037 kg/L密度梯度液10 mL混勻,小心移至離心管中液體上層,形成不連續密度梯度。將2-4個離心管置入低溫離心機中,先800 r/min離心5 min,然后2 500 r/min離心15 min,離心后在1.096-1.054 kg/L之間收集純化的胰島,4℃離心洗滌2次。分別取樣鏡檢計數,估計純度和行生物學活性及組織學鑒定。
    3. 胰島計數和純度測定
    分離純化后的組織懸液用雙硫腙(雙硫腙10 mg,無水乙醇3 mL,250 g/L氨水50 mL)進行染色,光鏡下胰島細胞團染成腥紅色或紅色,外分泌組織不著色,呈圓形、橢圓形或不規則形.在顯微鏡下計數直徑≥50 mm的胰島算出每克胰腺組織分離的胰島當量數,純度用內、外分泌組織量的比值來估計。
    4. 胰島生物學活性鑒定
    將純化后胰島細胞懸液放置在顯微鏡下,用巴氏吸管吸取胰島放入培養板中,每10個胰島當量(每1個胰島當量相當于直徑150 mm的胰島細胞團,IE)的成年豬胰島(APIs)置入一個培養孔,6孔為1組,共4組.每組分別置入無糖培養基、含5.6 mmoL/L葡萄糖(低糖)、16.7 mmoL/L葡萄糖(高糖)、16.7 mmoL/L葡萄糖加10 mmoL/L茶堿(高糖 茶堿)的RPMI1640培養液中,置于37℃、含50 mL/L CO2的培養箱中孵育4 h,收集培養液,用胰島素放免試劑盒(中科院原子能研究所)測定胰島素含量.
    5. 胰島組織學檢查
    離心純化后胰島細胞懸液,收集胰島組織,用無水酒精固定,石蠟包埋切片,HE染色檢查胰島組織結構完整性。
    6. 統計學處理
    所得數據以mean±SD表示,組間均數差異用t檢驗比較,P<0.05為有差異。

    滬公網安備 31011402005168號

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