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    公司動態

    如何搞定免疫熒光

          **熒光是標記**技術發展*早的一種,它是在**學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術,通過將抗體與一些示蹤物質結合,利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。**熒光步驟包括,細胞固定和通透,封閉,孵育一抗,二抗等。除了這些基本步驟,以下建議可以幫助您獲得更好的實驗結果。
          1、細胞固定和通透
          為達到*佳的檢測效果,細胞需要經過固定和通透。這些步驟非常關鍵,細胞和抗原需要保證*佳的結構,并利于抗體與抗原結合。通常情況下,需要通過以下步驟得以實現:細胞用2%-4%多聚甲醛固定,之后用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100進行通透。前者是比較溫柔的處理,但是對于核內抗原可能無效,需要用到Triton。使用皂角苷進行通透時,要注意它會引起細胞膜的可逆性通透,也就是除了在通透初期,在每個抗體孵育環節都需要進行通透。另外,細胞可以用冰甲醇進行同時固定和通透,可以避免去垢劑的使用。
          2、抗體特異性
          **熒光需要用到特異性非常強的抗體,可以避免高背景和不理想的蛋白定位結果。在大多數情況下,純化抗體的效果很好,但是正確的對照可以幫助精準定位抗原。使用只有二抗染色的片子作為陰性對照,有利于減少降低背景干擾。
          3、合適的抗體稀釋比例
          通過優化抗體稀釋比例來優化染色,通常情況下1ug/ml的純化抗體或者1:100-1:1000的抗血清足夠達到特異性染色的結果。但在能保證低背景染色的前提下,可以通過增加濃度來提高信號強度。如果是**次使用該抗體或測定某抗原,強烈建議濃度梯度實驗。
          4、優化緩沖液和封閉劑
          盡管很多抗原在常見的Buffer如PBS中可以很好的被染色,但是對于某些目的抗原,更換一下含有不同離子的緩沖液,比如鈣、鎂、鉀等,可以帶來很大程度上的改善。Rockland可提供優化過的IHC用封閉緩沖液,同樣適用于熒光染色實驗。
          5、選擇正確的二抗
          如果您需要做**實驗,我們強烈建議您選擇進行過預吸附的二抗進行單染實驗;如果是雙重甚至是多重染色,那么必須使用預吸附的二抗。同時,請優先選擇來自同一物種的二抗。
          6、使用合適的細胞密度
          選擇合適的細胞數量進行染色,當細胞數量過多時,細胞結構不好,導致染色背景深,低細胞密度,會使細胞貼壁不佳,狀態不好。
          7、多重染色
          對同一樣本進行兩個不同抗原的檢測時,可以用各自的抗體進行同時染色,但要求兩個一抗的種屬來源不同,標記物不同,而二抗的種屬來源需保持一致。
          8、降低背景
          高背景是**熒光常見的問題,解決此問題可以用二抗來源的正常血清代替BSA做封閉液,降低抗體濃度,增加洗滌次數,洗滌至少三次,每次五分鐘,推薦洗滌液為PBS+0.05%Tween。
          9、封片
          作為**熒光的*后一步,可以提高折射率,保護樣品。
          10、數據分析
          觀察整體樣片時,選擇具有代表性的細胞進行數據獲取與分析。

    滬公網安備 31011402005168號

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